Summary (Ph. D. thesis)

1. Acetylene hydratase from Pelobacter acetylenicus

P. acetylenicus is a strictly anaerobic and mesophilic bacterium that is able to grow on acetylene as single energy and carbon source. The first step in the metabolization of acetylene is the transformation of acetylene to acetaldehyde. This addition of water is catalyzed by the W/Fe-S dependent enzyme acetylene hydratase.

Acetylene hydratase from P. acetylenicus was purified to homogeneity. It is a monomer with a molecular mass of the amino acid chain of 81.9 kDa. BLASTP searches revealed that the enzyme is highly similar to enzymes of the DMSO-reductase family. Acetylene hydratase is a thermostable enzyme with a temperature optimum between 50 and 55°C. It is a very stable enzyme when stored under exclusion of dioxygen in a nitrogen/hydrogen atmosphere at 6°C. Within three months, there was no detectable loss of acetylene hydratase activity from tungstate-grown P. acetylenicus. Although acetylene hydratase catalyzes no redox reaction, it contains one [4Fe-4S] center and one W-bisMGD as redox-cofactors. ICP/MS, EPR, and UV/Vis-spectroscopy revealed that P. acetylenicus is able to insert tungsten as well as molybdenum into the bisMGD cofactor of acetylene hydratase. The highly active W-enzyme (42.3 U mg-1, 50°C) contained 3.5 mol iron and 1.1 mol tungsten per mol acetylene hydratase, whereas molybdenum was absent. The Mo-isoenzyme contained 3.1 mol iron, 0.5 mol molybdenum, and practically no tungsten per mol enzyme. The specific activity (16.7 U mg-1, 50°C) was significantly lower than the specific activity of the W-enzyme. A vanadium containing acetylene hydratase was not obtained. The purified enzyme from the corresponding vanadate cultivation contained practically no vanadium and only little amounts of tungsten and molybdenum (each ˜ 0.05 mol per mol acetylene hydratase). The specific activity was detectable but very low (2.6 U mg-1, 50°C). EPR-spectroscopic investigation of dithionite reduced acetylene hydratase from tungstate, molybdate (95Mo), and vanadate cultivation showed signals of [4Fe-4S] centers with gav = 1.97. The [FeIII(CN)6]3- oxidized enzymes from tungstate and vanadate cultivations exhibited resonances of a W(V) center. The enzyme from molybdate (95Mo) cultivation showed resonances of a 95Mo(V) center. UV/Vis spectra showed absorption shoulders resulting from the iron-sulfur clusters around 400 nm and from sulfur-to-tungsten charge-transfer transitions around 600 nm.

Crystals of W-acetylene hydratase were obtained both in the presence and in the absence of dioxygen (N2 : H2 = 94 : 6 v/v). The crystals, grown under exclusion of dioxygen in the presence of dithionite, diffracted to a resolution better than 2.5 Å. Crystallographic data were obtained at the Deutsche Elektronen Synchrotron (DESY) and were processed in collaboration with Dipl. Biol. Holger Nießen (Universität Konstanz) and Dr. Oliver Einsle (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried).

Sequencing of about 6000 bases of the acetylene hydratase gene-region showed an open reading frame (orf) in front of the acetylene hydratase gene that codes for a protein whose primary structure has no significant similarity to any other enzymes. In front of this orf there is another orf that was partially sequenced. It showed significant similarity to genes of reverse transkriptase/maturase proteins. Phylogenetic analyses, based on amino acid sequences, revealed that acetylene hydratase belongs to the family of the DMSO-reductases. This family can be divided into seven subfamilies, namely the DMSO-reductase subfamily, the oxidoreductases with unknown activity subfamily, the polysulfide/thiosulfate-reductase subfamily, the acetylene hydratase subfamily, the nitrate reductase subfamily, and the formate-dehydrogenase subfamily. An oxidoreductase with unknown activity from Streptomyces coelicolor is the only member of the seventh subfamily.

2. Transhydroxylase from Pelobacter acidigallici

P. acidigallici is a strictly anaerobic bacterium that is able to live on gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid), pyrogallol (1,2,3-trihydroxybenzene), phloroglucinol (1,3,5-trihydroxy-benzene), or 2,4,6-trihydroxybenzoic acid. A crucial step in the fermentation of decarboxylated gallic acid (pyrogallol) is the transhydroxylation of pyrogallol to phloroglucinol. This reaction is catalyzed by the Mo/Fe-S dependent enzyme transhydroxylase (pyrogallol:phloroglucinol hydroxyltransferase E.C. 1.97.1.2).

Transhydroxylase from P. acidigallici was purified to homogeneity by a new purification protocol. It is a heterodimer consisting of a large subunit (100.4 kDa) and a small subunit (31.3 kDa). BLASTP searches showed that the large subunit is closely related to enzymes of the DMSO-reductase family. Although the overall reaction of transhydroxylase is no redox reaction it contains different iron-sulfur centers and one Mo-bisMGD as redox-cofactors. EPR-spectroscopic investigation of transhydroxylase in the "as isolated" state showed typical signals of a Mo(V) center with gav = 1.98. The dithionite reduced enzyme showed signals of different [4Fe-4S] centers. The existence of [2Fe-2S] centers was not explicitly demonstrated. UV/Vis spectra showed absorption shoulders resulting from the iron-sulfur centers around 400 nm and from sulfur-to-molybdenum charge-transfer transitions around 700 nm. The specific activity of transhydroxylase (4.5 U mg-1) was about 50% higher than previously reported.

BLASTP searches with the small subunit of transhydroxylase as template showed that 12 of the 13 cysteines are highly conserved within related enzymes. Some of them are referred to as
[4Fe-4S] ferredoxins. The 15 cysteines of the big subunit do not align with the cysteines of related iron-sulfur proteins. Therefore, it is unlikely that an iron-sulfur center is located on the large subunit. It is more likely that there are three [4Fe-4S] clusters located on the small subunit.

Crystals were obtained both in the presence and in the absence of dioxygen (N2 : H2 = 94 : 6 v/v). The crystals, grown under exclusion of dioxygen in the presence of dithionite, diffracted to a resolution better than 3.4 Å. Refinement of the crystallization conditions led to crystals which diffracted to resolutions better than 2.5 Å with synchrotron radiation. The crystallographic investigation of transhydroxylase was done in collaboration with Dipl. Biol. Holger Nießen (Universität Konstanz) and Dr. Oliver Einsle (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried).

Phylogenetic analyses of the large subunit of transhydroxylase (based on amino acid sequences) revealed that transhydroxylase also belongs to the family of the DMSO-reductases. In contrast to acetylene hydratase, transhydroxylase belongs to the subfamily of the DMSO-reductases that consist of at least five distinct groups: The group of the Rhodobacter DMSO-reductases, the group of the TMAO-reductases, the group of the BSO-reductases, the group of the DMSO-reductases of the proteobacteria, and the transhydroxylase group.

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Zusammenfassung (Doktorarbeit)

1. Acetylenhydratase aus Pelobacter acetylenicus

P. acetylenicus ist ein mesophiles, strikt anaerob lebendes Bakterium, das in der Lage ist, auf Acetylen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen. Die Metabolisierung von Acetylen wird durch das W/Fe-S abhängige Enzym Acetylenhydratase eingeleitet, wobei in einer ungewöhnlichen Reaktion Acetylen zu Acetaldehyd hydratisiert wird.

Das Enzym Acetylenhydratase wurde aus P. acetylenicus zur Homogenität gereinigt. Es handelt sich um ein Monomer mit einer molekularen Masse der Aminosäurekette von 81.9 kDa. Das Enzym gehört zur Familie der DMSO-Reduktasen. Acetylenhydratase ist ein thermostabiles Enzym, dessen Temperaturoptimum im Bereich von 50 bis 55°C liegt. In einer Stickstoff/Wasserstoff Atmosphäre bei 6°C konnte das Enzym 3 Monate gelagert werden, ohne daß ein Aktivitätsverlust festgestellt wurde. Obwohl die Acetylenhydratase keine Redox-Reaktion katalysiert, enthält sie ein [4Fe-4S] Zentrum und einen W-bisMGD Kofaktor. Mittels ICP/MS, EPR und UV/Vis wurde gezeigt, daß P. acetylenicus in der Lage ist, sowohl Wolfram als auch Molybdän in den bisMGD Kofaktor einzubauen. Das hochaktive W-Enzym (42,3 U mg-1, 50°C) enthält 3,5 Eisen und 1,1 Wolfram. Molybdän hingegen war nicht vorhanden. Das Mo-Isoenzym enthält 3,1 Eisen, 0,5 Molybdän und praktisch kein Wolfram. Die spezifische Aktivität (16,7 U mg-1, 50°C) ist signifikant geringer als die spezifische Aktivität des W-Enzyms. Eine Vanadium-abhängige Acetylenhydratase konnte nicht erhalten werden. Das gereinigte Enzym der Vanadium-Anzucht enthielt praktisch kein Vanadium und nur wenig Wolfram und Molybdän (beide etwa 0,05 mol pro mol Acetylenhydratase). Die spezifische Aktivität war sehr gering (2,6 U mg-1, 50°C). Die EPR-Spektren Dithionit-reduzierter Acetylenhydratase aus den Wolframat, Molybdat und Vanadat Anzuchten zeigten typische Signale von [4Fe-4S] Zentren bei gav = 1,97. Das mit [FeIII(CN)6]3- oxidierte Enzym der Wolframat und Vanadat Anzucht zeigte Resonanzen eines W(V) Zentrums, das Enzym der Molybdat (95Mo) Anzucht die eines 95Mo(V) Zentrums. Im UV/Vis Spektrum erkennt man die breiten Absorptionsschultern der Eisen-Schwefel Zentren bei etwa 400 nm und Schwefel?Wolfram Ladungstransfer Übergänge um 600 nm.

Kristalle der W-Acetylenhydratase wurden in Anwesenheit und in Abwesenheit (N2 : H2 = 94 : 6 v/v) von Luftsauerstoff erhalten. Dithionit-reduziertes Enzym ergab, unter Ausschluß von Luft-sauerstoff, Kristalle, die am Deutschen Elektronen Synchrotron (DESY) in Hamburg vermessen wurden und bis zu Auflösungen unter 2,5 Å streuten. Die Verfeinerung der Kristallisations-bedingungen und die Strukturlösung wird im Moment am Max-Planck-Institut für Biochemie und an der Universität Konstanz, in Zusammenarbeit mit Dipl. Biol. Holger Nießen (Universität Konstanz) und Dr. Oliver Einsle (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried), weiter-geführt.

Die Sequenzierung von etwa 6000 Basen der Acetylenhydratase-Genregion ergab, daß direkt vor der Acetylenhydratase ein offenes Leseraster (orf) liegt, welches für ein Protein kodiert, dessen Primärstruktur keine signifikante Homologie zu anderen Proteinen aufweist. Vor diesem orf liegt ein weiteres Leseraster, das ansequenziert wurde. Es weist eine signifikante Homologie zu Genen von Reverse Transkriptase/Maturase-Proteinen auf. Phylogenetische Untersuchungen auf Aminosäureebene zeigten, daß die Acetylenhydratase zur Familie der DMSO-Reduktasen gehört. Diese Familie unterteilt sich in sieben Unterfamilien: Die DMSO-Reduktasen, eine Unterfamilie von Oxidoreduktasen mit unbekannten Aktivitäten, die Polysulfid/Thiosulfat-Reduktase-Unterfamilie, die Acetylenhydratase-Unterfamilie, die Nitrat-Reduktase-Unterfamilie und die Formatdehydrogenase-Unterfamilie. Eine Oxidoreduktase mit unbekannter Aktivität aus Streptomyces coelicolor ist der einzige Vertreter der siebten Unterfamilie.

2. Transhydroxylase aus Pelobacter acidigallici

P. acidigallici ist ein strikt anaerob lebendes Bakterium, das in der Lage ist, mit Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure), Pyrogallol (1,2,3-Trihydroxybenzol), Phloroglucin (1,3,5-Tri-hydroxybenzol) oder 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu leben. Ein entscheidender Schritt während der Metabolisierung von decarboxylierter Gallussäure (Pyrogallol) ist die Transhydroxylierung des Pyrogallols zum Phloroglucin. Diese Reaktion wird von dem Mo/Fe-S abhängigen Enzym Transhydroxylase (Pyrogallol:Phloroglucin Hydroxyltransferase E.C. 1.97.1.2) katalysiert.

Mittels eines neuen Reinigungsverfahrens wurde das Enzym Transhydroxylase aus P. acidigallici zur Homogenität gereinigt. Es handelt sich um ein Heterodimer, das aus einer großen Untereinheit (100,4 kDa) und einer kleinen Untereinheit (31,3 kDa) besteht. Das Enzym ist eng mit Mitgliedern der DMSO-Reduktase Familie verwandt. Obwohl die Gesamtreaktion der Transhydroxylase keine Redoxreaktion ist, enthält das Enzym einen Mo-bisMGD Redoxkofaktor und verschiedene Eisen-Schwefel Zentren. Im EPR-Spektrum des "as isolated" Enzyms erkennt man ein Mo(V) Zentrum mit einem gav = 1,98. Das mit Dithionit reduzierte Enzym zeigt Signale von verschiedenen [4Fe-4S] Zentren. Die Anwesenheit von [2Fe-2S] Zentren kann nicht ausgeschlossen werden. Im UV/Vis Spektrum erkennt man die Absorptionsschulter der Eisen-Schwefel Zentren um 400 nm und die von Schwefel?Molybdän Ladungstransfer Übergängen bei 700 nm.

Mit BLASTP Suchen wurde gezeigt, daß 12 der 13 Cysteine der kleinen Untereinheit der Transhydroxylase hochkonserviert sind. Einige davon sind als [4Fe-4S] Ferredoxine beschrieben worden. Die 15 Cysteine der großen Untereinheit lassen sich nicht mit den Cysteinen anderer Proteine abgleichen. Aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, daß die Eisen-Schwefel Zentren sich auf der kleinen Untereinheit befinden.

Kristallisationsexperimente und der Beginn der Strukturaufklärung wurden in Zusammenarbeit mit Dipl. Biol. Holger Nießen und Dr. Oliver Einsle durchgeführt. Experimente mit "as isolated"-Transhydroxylase führten zu Kristallen, die im Röntgenstrahl nicht beugten. Die Kristallisation von Dithionit-reduzierter Transhydroxylase unter den anoxischen Bedingungen einer Stickstoff/Wasserstoff-Atmosphäre führte zu Kristallen, die zunächst bis 3,4 Å streuten. Durch Verfeinerungen der Kristallisationsbedingung konnten Kristalle erhalten werden, die mit Synchrotonstrahlung bis zu einer Auflösung unter 2,5 Å streuten.

Phylogenetische Untersuchungen auf Aminosäureebene zeigten, daß die Transhydroxylase ebenfalls zur Familie der DMSO-Reduktasen gehört. Im Gegensatz zur Acetylenhydratase gehört sie zur Unterfamilie der DMSO-Reduktasen, die sich in fünf Gruppen aufteilt: Die Gruppe der Rhodobacter DMSO-Reduktasen, die Gruppe der TMAO-Reduktasen, die Gruppe der BSO-Reduktasen, die Gruppe der DMSO-Reduktasen der Proteobakterien und in die Transhydroxylase-Gruppe.

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Publications Transhydroxylase
 
Albrecht Messerschmidt, Holger Niessen, Dietmar Abt, Oliver Einsle, Bernhard Schink and Peter M. H. Kroneck (2004).
Crystal structure of pyrogallol-phloroglucinol transhydroxylase, an Mo enzyme capable of intermolecular hydroxyl transfer between phenols.
PNAS, 101: 11571 - 11576

D.J. Abt, O. Einsle, H. Niessen, R. Krieger, A. Messerschmidt, B. Schink, and P.M.H. Kroneck (2002)
Crystallization and preliminary X-ray analysis of the molybdenum-dependent pyrogallol-phloroglucinol transhydroxylase of Pelobacter acidigallici.
Acta Cryst., D58, 343 - 345

C. Kisker, H. Schindelin, D. Baas, J. Rétey, U.R. Meckenstock, and P.M.H. Kroneck (1999)
A structural comparison of molybdenum cofactor containing enzymes.
FEMS Microbiol Rev., 22(5), 503 - 521

Hille R., Rétey J., Bartlewski-Hof U., Reichenbecher R., and Schink B. (1999)
Mechanistic aspects of molybdenum containing enzymes.
FEMS Microbiol. Rev., 22, 489 - 501

Reichenbecher W. and Schink B. (1999).
Towards the reaction mechanism of pyrogallol-phloroglucinol transhydroxylase of Pelobacter acidigallici.
Biochim. Biophys. Acta, 35843, 1 - 9

Reichenbecher W., Rüdiger A., Kroneck P.M.H., and Schink B. (1996)
One molecule of molybdopterin guanine dinucleotide is associated with each subunit of the heterodimeric Mo-Fe-S protein transhydroxylase of Pelobacter acidigallici as determined by SDS/PAGE and mass spectrometry.
Eur. J. Biochem., 237, 406 - 413

Publications Acetylene hydratase
 
R.U. Meckenstock, R. Krieger, S. Ensign, P.M.H. Kroneck, and B. Schink (1999)
Acetylene hydratase of Pelobacter acetylenicus: molecular and spectroscopic properties of the tungsten iron-sulfur enzyme.
Eur. J. Biochem., 264(1), 176 - 182

Rosner B.M., Rainey F.A., Kroppenstedt R.M., and Schink B. (1997)
Acetylene degradation by new isolates of aerobic bacteria and comparison of acetylene hydratase enzymes.
FEMS Microbiol Lett., 148(2), 175 - 180

B. Rosner and B. Schink (1995)
Purification and characterization of acetylene hydratase of Pelobacter acetylenicus, a tungsten iron-sulfur protein.
J. Bacteriol., 177, 5767 - 5772

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Summary (Diplomarbeit)

Nitrite reductases are key enzymes of the biogeochemical nitrogen cycle. They catalyze the six-electron reduction of nitrite to ammonia in the energy metabolism referred to as dissimilatory nitrate reduction to ammonia.
The topic of the present work was the purification and biochemical and spectroscopic characterization of the cytochrome c nitrite reductase from the sulfate reducing bacterium Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774). D. desulfuricans was cultivated with nitrite as terminal electron acceptor and DL-lactate as electron donor. The membrane bound cytochrome c nitrite reductase was purified to homogeneity by three chromatographic steps. The enzyme is a heterodimer with molecular masses of the two subunits of 60.4 and 17.5 kDa. The optical spectrum showed characteristic signals of c-type cytochromes. In the EPR spectrum signals of low-spin heme-Fe(III) centers were obtained. The first seven amino acids of the aminoterminal site were determined by Edman degradation.

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Zusammanfassung (Diplomarbeit)

Nitritreduktasen sind Schlüsselenzyme im biogeochemischen Stickstoffkreislauf und katalysieren die sechs-Elektronen-Reduktion von Nitrit zu Ammoniak innerhalb des Stoffwechselwegs der dissimilatorischen Nitratreduktion zu Ammoniak.
Ziel dieser Arbeit war es, die Cytochrom c Nitritreduktase des sulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) zu reinigen sowie biochemisch und spektroskopisch zu charakterisieren. Hierzu wurde D. desulfuricans mit Nitrit als terminalem Elektronenakzeptor und DL-Lactat als Elektronendonor kultiviert. Die membranständige Cytochrom c Nitritreduktase wurde in drei chromatographischen Schritten zur Homogenität gereinigt. Das Enzym ist ein Heterodimer mit einer molekularen Masse von 60,4 kDa der großen Untereinheit und von 17,5 kDa der kleinen Untereinheit. Das Elektronenanregungsspektrum zeigt Signale die charakteristisch für c-Typ Cytochrome sind. Im EPR Spektrum erkennt man Signale von low-spin Häm-Fe(III) Zentren. Durch Edmanabbau wurden die ersten sieben Aminosäuren des aminoterminalen Endes der Aminosäuresequenz der Nitritreduktase ermittelt.

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